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Scientific Reports volume 12, Numéro d'article : 21413 (2022) Citer cet article 941 Accès 4 Citations Détails des métriques Dans ce travail, nous démontrons le développement d'un outil rapide et sans étiquette

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 21413 (2022) Citer cet article

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Dans ce travail, nous démontrons le développement d’un biocapteur électrochimique rapide et sans étiquette pour détecter Listeria monocytogenes à l’aide d’un nouveau matériau de nanobrosse thiomère stimulus-réponse. Des nanobrosses ont été développées via un co-dépôt simultané en une seule étape de nanoplatine (Pt) et de thiomères d'alginate (ALG-thiomère). La plate-forme de nanobrosse ALG-thiomère/Pt a considérablement augmenté la surface électroactive moyenne des électrodes de 7 fois et a maintenu les propriétés d'actionnement (gonflement osmotique stimulé par le pH) de l'alginate. Le comportement diélectrique lors de l'actionnement de la brosse a été caractérisé avec des sondes redox chargées positivement, neutres et négativement au-dessus et au-dessous du point isoélectrique de l'alginate, indiquant que la charge de surface de l'ALG-thiomère joue un rôle important dans l'acquisition du signal. La plateforme ALG-thiomère a été biofonctionnalisée avec un aptamère sélectif de la protéine internaline A de Listeria pour des applications de biodétection. Le chargement des aptamères a été optimisé et diverses stratégies de capture cellulaire ont été étudiées (brosse étendue ou effondrée). La capture cellulaire maximale se produit lorsque l'ALG-thiomère/aptamère est dans la conformation étendue (pH > 3,5), suivie d'une mesure d'impédance dans la conformation effondrée (pH < 3,5). De faibles concentrations de bactéries (5 UFC mL−1) ont été détectées à partir d'une matrice alimentaire complexe (bouillon de poulet) et des tests de sélectivité contre d'autres bactéries Gram-positives (Staphylococcus aureus) indiquent que l'affinité avec l'aptamère est maintenue, même à ces valeurs de pH. Le nouveau matériau souple hybride est parmi les plus efficaces et les plus rapides (17 minutes) pour la biodétection de L. monocytogenes à ce jour, et ne nécessite pas de prétraitement des échantillons, constituant une nouvelle plate-forme matérielle prometteuse pour détecter de petites molécules ou cellules.

Listeria monocytogenes est une bactérie virulente d'origine alimentaire omniprésente dans l'environnement (sol et eau) qui provoque des centaines de décès chaque année aux États-Unis1,2. Chaque année, près de 48 millions de cas de maladies d'origine alimentaire sont signalés, dont près de 19 % sont dus à une infection à Listeria monocytogenes, ce qui pourrait avoir un impact économique négatif de 15 milliards de dollars en termes de coûts de santé, de perte de productivité et de décès3,4. Avec des symptômes tels que des douleurs musculaires, des nausées, de la diarrhée, des vomissements et des frissons1, L. monocytogenes est l'un des agents pathogènes d'origine alimentaire les plus mortels, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 30 % chez les individus à haut risque5,6. C'est particulièrement dangereux pour les femmes enceintes, même si elles se rétablissent généralement, leurs bébés risquent de ne pas survivre2.

Listeria monocytogenes est un agent pathogène difficile à surveiller dans les environnements de transformation des aliments en raison de sa capacité à proliférer dans des conditions de faible teneur en humidité, de salinité élevée ou à des températures associées aux réfrigérateurs/congélateurs courants7. Une règle de tolérance zéro pour L. monocytogenes dans les aliments prêts à consommer a été mise en œuvre par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, le Département de l'agriculture des États-Unis (USDA) et l'Union européenne (UE)1, aggravée par la Le nombre croissant de rappels d’aliments liés à la contamination par Listeria au cours des dernières années8 renforce encore la nécessité de méthodes de détection des agents pathogènes en temps réel, capables d’identifier les produits alimentaires contaminés avant d’atteindre le public.

L'état de l'art actuel en matière de détection de Listeria dans les usines de transformation des aliments, y compris le dénombrement total viable (TVC), l'ELISA (essais immuno-enzymatiques) et la PCR (réaction en chaîne par polymérase), sont sensibles aux erreurs et aux fausses lectures. et nécessitent des laboratoires coûteux avec un personnel hautement qualifié9,10. Les résultats des tests de ces méthodes sont considérablement retardés car ils nécessitent deux étapes d'enrichissement consécutives (jusqu'à 48 h) pour concentrer/amplifier les bactéries avant une étape de détection qualitative11, car ces méthodes manquent de sensibilité [~ 100 UFC mL−1 limites de détection (LOD) ]12,13 et ne peut pas détecter directement de faibles niveaux d'agents pathogènes dans des échantillons complexes tels que des milieux, des bouillons ou des tissus homogénéisés.

 0.97), the sensitivity to the target bacterium was obtained using the slope of the linear portion and then the 3σ method was used to calculate the limit of detection (LOD)39. Change in impedance (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{bacteria}-{Z}_{no \, bacteria}\)) was used to illustrate the electrodes performance independent of media. Selectivity to L. monocytogenes was evaluated by determining sensitivity and LOD in the presence of the identical concentration of another Gram-positive bacteria (S. aureus) in PBS and in sterile vegetable broth./p> 3.5 is noted as (EX), the collapsed brush conformation at pH < 3.5 is noted as (COL), the cell capture state is noted by (cap) and the electrochemical measurement step is noted by (meas). Cell capturing in the extended conformation (pH 7) and sensing at collapsed state (pH 3) provided the highest impedance values (p < 0.05) for all cutoff frequencies and, therefore, sensing efficiency (see also Bode plots in Fig. S3 in the supporting information). The optimum capture of targeted bacteria at the extended form can be related to a higher contact area with the tested solution and an increased probability of aptamer-cell interaction, compared to pH 3 at which the brushes are contracted, and the receptor binding site(s) may be inaccessible. Similar to our previous work on this capture strategy, it is likely that the cells become entangled in the polymer matrix during the sensing step, where aptamer-target binding may no longer be the mechanism for cell capture but rather entanglement during nanobrush collapse. The specificity for this detection platform is rooted in the initial affinity between aptamer and target at pH 7 (extended ALG-thiomer nanobrush), where the collapse at pH 3 likely causes secondary structure changes in the aptamer but also entraps cells in the polymer matrix./p> 0.05) on the LOD (4.5 ± 0.8 CFU mL−1 with L. monocytogenes alone and 5.7 ± 2.1 CFU mL−1 with both bacteria) indicating no cross-reaction between the sensor and S. aureus. The sensitivity increased (p < 0.05) from 39.21 ± 2.61 Ω/log(CFU mL−1) with L. monocytogenes alone to 69.34 ± 2.79 Ω/log (CFU mL−1) when S. aureus was also present. The linear range also changed from 101 to 106 CFU mL−1 with only L. monocytogenes in PBS to 101–105 CFU mL−1 in the bacteria mixture. Ohk et al.29 presented a LOD of 103 CFU mL−1 using the same aptamer in a fiber-optic biosensor to detect Listeria spp. Recently, Oliveira et al.31 using the same aptamer presented similar LODs compared to the current study for L. monocytogenes alone in PBS and in the presence of S. aureus, 2.5 and 2.6 CFU mL−1, respectively; using actuation of chitosan/platinum brushes. While antibody sensors are reported to be prone to give false-positive reactions with S. aureus, which is also a protein A carrier, the aptamer used in the present work was proven to be selective to L. monocytogenes29. This aptamer targets the surface protein Internalin A which is one of the major invasion proteins involved in pathogenesis29. Despite the fact that this protein is structurally analogous to certain cell-wall proteins with internal repeats identified in members of the genera Staphylococcus and Streptococcus65, the present results corroborate that this aptamer can be selective to L. monocytogenes./p> 0.05) to the results in PBS. These results also indicate that the aptamer is able to selectively bind to L. monocytogenes even in complex food matrices. Using the same aptamer, Hills et al.30 reported a slightly higher LOD of 9.1 CFU mL−1 in vegetable broth with a layer by layer reduced graphene oxide/nanoplatinum/chitosan brush electrode that actuated based on chitosan’s pH-response./p>